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无参转录组测序

来源: 本站原创    作者:佚名   发布时间:2015/3/31 10:59:52

 现存物种数最粗略范围是300万~1亿,认可范围是500万~1500万,已定名或记录的有174万种(1995年Hammond 统计)或150万种,还有大量物种没有参考基因组序列,需要我们进行研究。目前对于无参考基因组物种的转录组测序,首先需要拼接得到尽可能全面的转录本信息,这就需要选择有较长读长的测序平台,长读长能够更有效地跨越复杂基因组的高度重复区域,能够显著提高转录组组装结果,更高的组装结果将更有利于进行基因注释和基因功能的深入挖掘,使得转录本结构研究和结构变异的研究更加准确和可靠。 

一、技术路线

Roche 454 FLX+、Illumina MiSeq、Illumina Nextseq 500和 Illumina HiSeq 2500

 

二、生物信息分析

►标准信息分析

1 原始数据整理、过滤及质量评估
2 转录组拼接
3 Unigene聚类
4 GO注释
5 eggNOG分类注释
6 KEGG分类注释
7 Unigene的表达量分析
8 Unigene的表达量差异分析(样本数≥2)
9 差异表达的Unigene的聚类分析(热图)(样本数≥3)
10 差异表达的Unigene的富集分析(GO、KEGG) (样本数≥2)
11 cSNP分析
12 SSR开发分析及引物设计(仅针对真核生物)
13 ORF分析
14 Indel分析

►高级信息分析

1、主成分分析(五个或五个以上样品);
2、条件特异表达分析(五个或五个以上样品)。
 

三、结果展示

 

   

四、样品要求 

1. 总RNA:针对Illumina测序平台,浓度≥80 ng/ul,总量≥12 μg;针对Roche 454 FLX+平台,浓度≥200 ng/μl,总量≥50 μg;OD260/280介于1.8-2.2之间,OD260/230值应≥2.0。电泳检测28S:18S至少大于1.5;并确保RNA无降解,无污染;或提供浓度≥50 ng/μl,总量≥1 μg的mRNA。同时,提供质量检测相关数据和图片,包括分光光度计、电泳胶图或Nanodrop仪器检测数据。一般不建议提供mRNA,较难定量。

2. 组织样品:动物、植物、微生物总量大于500 mg的新鲜样品(植物材料应尽量选取幼嫩部位)。采样后将样品立即用RNAlater和液氮速冻,保存于-80℃(保存期不超过一个月),送样时使用干冰运输(不超过72 h);提取RNA后经变性电泳,保证各RNA条带清晰、比例适中、完整性好、无降解。特别要求样品分成3份,方便后续提取,避免同一份样品反复冻融造成样品降解。


3. 细胞样品:先使用TRIzol试剂进行处理,每0.25 mL样品(5-10×106 个细胞)加入0.75 mL TRIzol试剂(可参考TRIzol试剂说明书),于-80℃保存,并提供2-3份该样品。原则上不接收未经TRIzol处理的细胞样品。


4. 样品保存期间切忌反复冻融。


5. 送样管务必标清样品编号,管口使用Parafilm膜密封。 

五、迪巧的优势

1.拥有标准化操作实验室和适合无参考基因组的转录组测序的Illumina Nextseq 500、Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2500以及Roche 454 FLX+等多种高通量测序技术平台,实验周期短,质量可靠。

2.技术人员经验丰富,可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。


3.拥有专业的生物信息团队和完整的生物信息分析服务体系,除提供标准化生物信息服务外,还可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。


4.拥有标准的、实时更新的项目进展流程,有助于合作伙伴及时了解项目进展最新情况。


5.迪巧生物免费提供文章写作指导服务和文章润色服务。

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